Дженнифер Энистон родилась 11 февраля 1969 года, в городке Шерман-Окс (штат Калифорния, США) в семье американского актёра греческого происхождения Джона Энистона (урождённый Яннис Анастассакис, родом с острова Крит) и Нэнси Доу (1936—2016), актрисы с шотландскими и итальянскими корнями. У Дженнифер есть два брата — Джон Мелик (старший) и Алекс Энистон (младший). Крёстный отец Энистон — греко-американский актёр Телли Савалас, лучший друг её отца. Её дед (по фамилии Анастассакис) приехал в США из Греции и стал владельцем закусочной.

Энистон училась в штайнеровской школе в Нью-Йорке. В школьном драматическом кружке проявился её актёрский талант. В этой же школе проявились и её способности к рисованию.

Когда девочке было 9 лет, её родители развелись. Она осталась с матерью, но часто ездила к отцу в Лос-Анджелес, где Джон Энистон играл одну из главных ролей в сериале «Дни нашей жизни». В 11 лет Дженнифер начала играть в драматическом кружке школы Рудольфа Штайнера. Своё профессиональное обучение она продолжила в 1987 году в нью-йоркской школе искусств LaGuardia, после окончания которой приняла участие в нескольких бродвейских постановках («For Dear Life», «Dancing on Checker’s Grave» и других). В этот период Энистон также подрабатывала курьером и занималась телефонным маркетингом.


В прошлом Энистон встречалась с музыкантом Адамом Дьюрицем и актёром Тейтом Донованом. Её серьёзные отношения с актёром Брэдом Питтом часто освещались в прессе. Она вышла замуж за Питта 29 июля 2000 года в Малибу. Пара объявила о расставании 7 января 2005 года, 25 марта Энистон подала на развод, и они развелись 2 октября того же года.

В 2011 году Энистон начала встречаться с актёром Джастином Теру, с которым познакомилась на съёмках фильма «Жажда странствий». В августе 2012 года пара обручилась. В ночь с 5 на 6 августа 2015 они поженились в их доме в Лос-Анджелесе. В феврале 2018 года Энистон и Теру объявили о расставании.

Энистон — православная христианка, является прихожанкой и благотворителем Спасо-Преображенского собора РПЦЗ в Лос-Анджелесе.