Уиллем Дефо родился в семье хирурга Уильяма Альфреда Дефо и медсестры Мюриэль Изабел. У актёра английские, шотландские, ирландские, немецкие, швейцарские, французские и итальянские корни. Седьмой ребёнок в семье с восемью детьми, лишь он один решил избрать артистическую стезю — остальные стали адвокатами или медиками. Изучал драматическое искусство в университете Милуоки (University of Wisconsin-Milwaukee), не доучившись, отправился на гастроли с авангардным театром «Theatre X». После четырёх лет гастролей по США и Европе обосновался в Нью-Йорке и стал членом театральной труппы «The Performance Group», позже преобразованной в The Wooster Group.

Первую роль сыграл в 1980 году в фильме Майкла Чимино «Врата рая», однако кадры с его участием были вырезаны. По-настоящему первым появлением на большом экране для Дефо стала драма Кэтрин Бигелоу «Без Любви», в которой он исполнил роль лидера банды байкеров. После этого последовали роли в «Улицах в огне» Уолтера Хилла и «Жить и умереть в Лос-Анджелесе» Уильяма Фридкина. Однако всемирную известность Дефо принёс «Взвод» Оливера Стоуна. Военная драма была признана лучшим фильмом года, а актёр получил свою первую номинацию на «Оскар». В 1988 году Дефо сыграл одну из своих главных ролей — актёр предстал в образе Иисуса в противоречивой драме Мартина Скорсезе «Последнее искушение Христа».